培养条件

培养条件包括DMEM+10% FBS+1% P/S，适用于贴壁细胞。培养温度设定为37℃，首次传代建议采用1:2的比例。传代过程中，每两天需更换培养液。建议同时购买培养基和细胞，以获得优惠。收到细胞后，应将其处理至良好状态，灌满完全培养液后封好瓶口，以确保运输安全。

细胞处理步骤

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整瓶，进行消毒处理，随后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并记录不同放大倍数下的照片（建议拍摄40x、100x、200x各一张）。前两天的观察照片为售后提供的重要依据，若未提供照片则默认收到的细胞状态良好。

细胞传代步骤

a. 贴壁细胞传代

如果细胞的汇合度未超过80%，需将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放置于37℃、5% CO2的孵箱中。如果细胞密度超过80%，则可进行传代。步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液于培养瓶中，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态。若细胞大部分变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶并加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落，吸出悬液至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。

b. 悬浮细胞传代

悬浮细胞的处理步骤如下：

1. 半换液法：将培养瓶竖直静置1小时，轻轻吸掉约3ml培养基，补充3ml全培养基；若培养基变色慢，加500μl FBS，传代时补给5ml培养基，分为两个培养瓶。
2. 离心换液法：收集细胞悬液到离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清，重悬后按1:2比例分到新T25瓶中，添加6-8ml新培养基。

细胞冻存与复苏

c. 细胞冻存

细胞生长至80%汇合度时，按以下步骤冻存：

1. 弃去培养液，PBS清洗细胞。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹打使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后期要转入液氮罐，需先在-80℃存放24小时以上。

d. 细胞复苏

复苏细胞时应遵循以下步骤：

1. 从液氮中取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴中解冻，待完全解冻后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

注意事项

有些细胞在运输过程中可能会发生脱落，这是正常现象。如脱离数量较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。沉淀中的细胞加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后消化1-2分钟，然后加入5ml完全培养基终止消化。再离心、弃上清并重悬，最后按1:2比例进行分瓶传代，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

在细胞培养的过程中，选择尊龙凯时人生就博品牌的培养基和试剂，确保细胞生长的最佳状态同时也能获得良好的经济效益。